Vi sinh vật học -6

Vỏ nhày ở nấm men

Một vài loài nấm men gây bệnh ở người:

Candida albicans Cryptococcus neoformans
Để phân loại nấm men người ta phải tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sau đây:
*Đặc điểm hình thái: tế bào, khuẩn lạc, kiểu nẩy chồi, các dạng bào tử vô tính và hữu
tính, khuẩn ty và khuẩn ty giả
*Đặc điểm sinh lý và sinh hoá:
- Lên men 13 loại đường
- Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio
Mérieux SA, Marchy-l’Étoile…)
- Tính chống chịu với 0,01% hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ
kit ID 32C).
- Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine,
cadaverine dihydrochloride, creatine
- Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate,
biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid.
- Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 35, 37, 42
0
C.
- Tạo thành tinh bột.
- Sản sinh acid từ glucoz
- Thủy phân Urê
- Phân giải Arbutin
- Phân giải lipid
- Năng lực sản sinh sắc tố
- Sinh trưởng trên môi trường chứa 50% và 60% glucoza
- Hóa lỏng gelatine
-Phản ứng với Diazonium Blue B
- Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1%
Để xác định loài mới còn cần phân tích thành phần acid béo của tế bào, thành phần
đường trong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch, giải
trình tự ADN và lai ADN
B - CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM DÙNG ĐỂ ĐỊNH TÊN NẤM MEN

1. Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước
Khi xác định hình thái và kích thước tế bào nấm men người ta thường nuôi cấy nấm men trong
môi trường thạch - mạch nha và môi trường mạch nha dịch thể. Nếu sử dụng các môi trường
khác thì hình thái và kích thước tế bào nấm men có thể thay đổi, không phù hợp với hình thái
và kích thước tiêu chuẩn đã được ghi trong bảng phân loại.
- Môi trường mạch nha: Lấy lúa đại mạch đã ủ cho nảy mầm (loại nhập khẩu dùng để
làm bia), đem phơi khô rồi xay nhỏ thành bột. Cân 1kg bột này, thêm 3 lít nước, giữ ở 60
0
C để
đường hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với dịch Lugol không thấy có màu xanh lam). Lọc lấy
dịch trong có thể thêm 3 lòng trắng trứng rồi trộn đều, đun sôi rồi lọc lấy dịch trong. Điều
chỉnh bằng nước để có nồng độ đường đạt 6
o
Baume.
Phân vào các dụng cụ thuỷ tinh đã khử trùng. Nếu làm môi trường đặc thì thêm 2% thạch. Tốt
nhất là dùng mầm đại mạch, nếu không thì có thể dùng mầm lúa. Nồng độ thích hợp để nuôi
cấy nấm men dùng khi phân loại là 5,7
o
Baume. Có tài liệu lại sử dụng nồng độ 5-8
0
Baume.
Nấm men được nuôi cấy trong các ống nghiệm thạch nghiêng hoặc các ống nghiệm đựng 3 ml
môi trường dịch thể. Nuôi cấy ở 25-30
0
C trong 3 ngày, sau đó lấy ra làm tiêu bản và quan sát.
Muốn đo kích thước tế bào nấm men người ta thường sử dụng trắc vi thị kính). Số tế bào nấm
men được đo không ít hơn 20. Chú ý là phải đo các tế bào trưởng thành chứ không đo các chồi
mới nảy sinh. Tế bào nấm men có hình thái và kích thước khác nhau tuỳ loài, tuỳ chi. Chúng có
thể có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh châu Âu, hình ống v.v Khi quan
sát tế bào nấm men dưới kính hiển vi có thể phân biệt được thành tế bào, tế bào chất, không
bào (vacuole) và các hạt dị nhiễm (metachromatic granules). Thành tế bào nấm men thẫm
hơn so với nguyên sinh chất, còn không bào thường có hình tròn, màu nhạt hơn. Các hạt dị
nhiễm thường bắt ánh sáng mạnh hơn, chúng lắc lư trong nguyên sinh chất theo chuyển động
Brown. Kích thước của tế bào nấm men khác nhau rất nhiều tuỳ loài thuỳ chi, tuỳ điều kiện
sinh trưởng và có thể thay đổi trong khoảng 1-5 x 5-30àm hay có khi dài hơn nữa. Kích thước
tế bào của các loại nấm men thông thường vào khoảng 4-5àm.

2. Nhuộm màu tế bào nấm men:
Muốn quan sát tế bào nấm men một cách tỷ mỷ hơn người ta thường sử dụng các loại thuốc
nhuộm để nhuộm cả tế bào hoặc một số phần tế bào nấm men. Có thể dùng một trong những
loại dung dịch thuốc nhuộm sau đây:
- Dung dịch Lugol:
Iot 2g
Iodua Kali 4g
Nước cất 100ml
(Nghiền nhỏ I và KI trong cối sứ rồi sau đó dùng nước hoà tan dần).
- Dung dịch xanh methylen (methylene blue)
Xanh methylen 1g
Nước cất 1000ml
(Có thể pha thành dung dịch 1% sau đó lọc rồi dùng nước cất pha loãng thêm 10 lần nữa).
- Dung dịch fuchsin cacbolic:
Fuchsin kiềm (basic fuchsin) 0,1g
Cồn 90
0
10ml
Dung dịch phenol 3% 90ml
(Hoà tan fuchsin trong cồn, sau đó trộn đều vào dung dịch phenol).
Có thể dùng que cấy, phết dịch nuôi cấy nấm men thành một lớp mỏng trên phiến kính
sau đó làm khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylen hay fuchsin cacbolic như khi
nhuộm tiêu bản vi khuẩn. Thường người ta dùng lamelle (lá kính mỏng) để quan sát tế bào
nấm men. Lấy một phiến kính sạch nhỏ lên đó một giọt thuốc nhuộm (xanh methylen chẳng
hạn). Giọt thuốc nhuộm không nên to quá (về sau sẽ tràn khỏi lamelle), cũng không nên nhỏ
quá (tạo thành nhiều bọt khí khi đậy lamelle). Lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 2-3 ngày hoà
vào giọt thuốc nhuộm. Đặt một cạnh của lamelle sát vào phía ngoài giọt mẫu rồi hạ từ từ
lamelle xuống cho giọt mẫu tràn đều khắp lamelle. Nếu tràn ra ngoài thì dùng giấy lọc thấm
bớt. Soi ở vật kính nhỏ trước, sau đó chuyển sang vật kính lớn. Có thể căn cứ vào mức độ bắt
màu đậm nhạt để phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. Muốn quan sát các hạt glycogen
trong tế bào nấm men thì nhuộm bằng dung dịch Lugol. Tế bào sẽ có màu vàng nhạt còn các
hạt glicogen có màu đỏ nâu. Muốn quan sát các giọt mỡ trong tế bào nấm men có thể làm tiêu
bản như sau:
Rỏ một giọt formalin lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít nấm men đã nuôi cấy 48-
72 giờ hoà vào giọt formalin. Để yên 5 phút sau đó thêm một giọt dung dịch thuốc nhuộm
xanh methylen, lại thêm một giọt thuốc nhuộm soudan III. Đặt lamelle dưới kính hiển vi rồi
quan sát ta sẽ thấy nguyên sinh chất của tế bào nấm men bắt màu lam nhạt, không bào
không bắt màu còn các giọt mỡ có màu đỏ hồng.
- Thuốc nhuộm soudan III:
Soudan III 0,05g
Cồn 90% 100ml
Cũng có thể nhuộm các giọt mỡ bằng phương pháp sau đây: Lấy thuốc nhuộm đen
Soudan B (Soudan black B) cho vào ống nghiệm. Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà vào
dịch thuốc nhuộm này. Giữ 20 phút. Lấy khoảng 2 vòng que cấy dịch thuốc nhuộm có nấm
men phết lên phiến kính. Làm khô tự nhiên. Nhuộm tiêu bản trong 30 giây bằng dịch thuốc
nhuộm safranin. Rửa nước, đợi khô rồi soi kính. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men sẽ có
màu đỏ nhạt còn các giọt mỡ có màu đen lam.
- Thuốc nhuộm đen Soudan B (theo Burdon):
Soudan black B 0,3g
Cồn 70% 100ml
(Trộn đều, để 24 giờ rồi mới sử dụng. Dùng trong vòng một tháng).
- Thuốc nhuộm safranin:
Dịch safranin 2,5% (trong cồn 95%) 10ml
Nước cất 100ml
Muốn nhuộm nhân của tế bào nấm men có thể sử dụng phương pháp sau đây:
Lấy một giọt nước đặt lên 1 phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men hoà vào giọt nước
đó rồi dàn thành vết mỏng. Làm khô tự nhiên. Thêm vài giọt dung dịch picroformol, giữ vài
phút sau đó rửa bằng cồn 70%. Ngâm tiêu bản vào trong dung dịch FeNH
4
(SO
4
).12H
2
O 3%
trong 4-7 giờ. Lấy tiêu bản ra dùng nước rửa sạch sau đó lại ngâm vào dịch thuốc nhuộm
hematoxilin 10% trong 24 giờ. Lấy ra rửa nước rồi lại ngâm vào dịch FeNH
4
(SO
4
).12H
2
O cho
đến khi vừa mất màu thì lấy ra rửa sạch bằng nước, làm khô rồi soi kính. Nguyên sinh chất của
tế bào nấm men có màu tro còn nhân tế bào có màu đen.
- Dung dịch nhuộm nhân tế bào:
+ Dung dịch picroformol:
Dung dịch acid picric bão hoà 75 phần
Axetit acetic glacial 5 phần
Dung dịch fomol loãng 20 phần
+ Dung dịch ngâm FeNH
4
(SO
4
)
2
.12H
2
O
FeNH
4
(SO
4
)
2
.12H
2
O 3g
Nước 100ml
+ Dung dịch thuốc nhuộm hematoxilin
Hematoxilin 1g
Cồn 10ml
Nước 90ml
Hoà tan hematoxilin trong cồn, sau đó thêm nước, đậy nút bông rồi để 1 tháng sau mới sử
dụng.
Để quan sát tế bào nấm men có thể dùng dung dịch nigrozin 5%. Khi đó tế bào sẽ không bắt
màu, có thể phân biệt rõ trên một nền màu lam đen.
Để quan sát bào tử túi (tránh lầm với các không bào) có thể sử dụng một số các phương pháp
nhuộm bào tử đã được giới thiệu trong chương IV (phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập
1 NXB KHKT 1971). Cũng có thể nhuộm bào tử túi bằng phương pháp sau đây: Rỏ 1 giọt nước
lên phiến kính. Dùng que cấy lấy một ít nấm men trộn vào giọt nước, dàn thành vết mỏng, để
khô tự nhiên.
Cố định trên ngọn lửa bằng đèn cồn, nhuộm bằng dung dịch lục malachit. Nhuộm 2 phút,
thường xuyên hơ trên ngọn lửa cho bốc hơi (không được đun sôi). Rửa nước nhẹ, nhuộm thêm
30 giây bằng dung dịch safranin 0,5% trong nước. Nang bào tử sẽ bắt màu xanh lục còn tế
bào dinh dưỡng có màu hồng.
- Dung dịch lục malachit:
Lục malachit (malachite green) 1g
Nước 100ml (không đun nóng)

3. Quan sát quá trình nảy chồi của tế bào nấm men
(sử dụng cho tế bào nấm men dinh dưỡng không có dạng sợi - non filamelletous vegetative
cells).
Cấy một vòng que cấy tế bào nấm men một ngày tuổi vào bình nón loại 100ml chứa
30ml môi trường dịch thể (môi trường nước chiết mạch nha, môi trường cao nấm men-pepton-
glucoza hay môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton).
- Môi trường mạch nha - cao nấm men - glucoza - pepton:
Cao mạch nha (malt extract) 3g
Cao nấm men (yeast extract) 3g
Glucoza 10g
Pepton 5g
Nước 1000ml
Nuôi cấy trong bình nón ở 25-28
0
C sau hai đến ba ngày tiến hành lấy mẫu quan sát. Khi
quan sát dưới kính hiển vi cần phân biệt được là nấm men sinh sản theo cách nảy chồi hay
phân cắt hoặc cả hai.
- Nếu nảy chồi thì chồi xuất hiện ở đâu? ở cả hai đầu (hai cực) hay ở vị trí bất kỳ nào
trên tế bào? Số lượng chồi trên tế bào mẹ?
- Chồi con sau khi phát triển có rời khỏi tế bào mẹ hay không?
- Dạng và kích thước của tế bào? Chú ý: phương pháp này phải dùng với các môi trường
xác định và ở pha sinh trưởng logarit của tế bào.

4. Quan sát khuẩn ty giả:
Có một số nấm men khi phát triển trong những môi trường nuôi cấy lâu hay trong
những điều kiện thiếu oxy có thể tạo thành những tế bào dài, xếp nối tiếp nhau, được gọi là
khuẩn ty (mycelium). Người ta phân biệt hai loại khuẩn ty: khuẩn ty giả và khuẩn ty thật.
Khuẩn ty thật là các tế bào dạng sợi có vách ngăn, khuẩn ty giả là các tế bào dạng sợi không
có vách ngăn. Việc tạo thành khuẩn ty là một đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm men.
Cũng có một ít loại nấm men khi phát triển bình thường cũng tạo thành khuẩn ty giả
(pseudomycelium).
Muốn kiểm tra việc tạo thành khuẩn ty người ta thường nuôi cấy nấm men trên môi
trường pepton - glucoza, môi trường khoai tây - glucoza hay môi trường ngô.
- Môi trường thạch - pepton - glucoza:
Pepton 10g
Glucoza 20g
Thạch 20g
Nước 1000ml
- Môi trường khoai tây - glucoza:
Nước chiết khoai tây 10% 1000ml
Glucoza 20g
Thạch 20g
Cách làm nước chiết khoai tây: cân 100g khoai tây đã gọt vỏ, rửa sạch và thái nhỏ,
thêm 300ml nước, hấp ở áp lực 1at trong 1 giờ sau đó bổ sung nước cho đủ 1000ml.
- Môi trường ngô:
cân 12,5g ngô, thêm 300ml nước đun cách thuỷ 60
0
C trong 1 giờ, lọc lấy nước trong.
Thêm nước cho đủ 300ml. Sau đó thêm 3,8g thạch. Hấp ở áp lực 1at trong 15 phút. Lọc nóng
qua bông thấm nước rồi phân vào các ống nghiệm và khử trùng ở áp lực 1at trong 15 phút.
Đổ môi trường vào hộp Petri. Dùng que cấy, cấy nấm men thành 3 cặp đường song
song ngắn, ở 3 chỗ. Dùng panh lấy lá kính mỏng (thường xuyên ngâm trong còn 70%) đốt nhẹ
hết cồn, để nguội một chút rồi cẩn thận đặt nhẹ nhàng lên vết cấy. Phải cấy thế nào để hai
đường cấy song song ở mỗi chỗ có chiều ngang nằm gọn giữa lá kính mỏng, hai đầu dài hơn lá
kính mỏng một chút (để sau này dễ quan sát). Cần chú ý là bề mặt thạch phải thật khô, khi
đậy lá kính mỏng, phải tránh bọt khí, đậy xong phải tránh di chuyển làm xô lệch lá kính mỏng.
Cũng có thể tiến hành theo phương pháp sau đây: đổ môi trường vào một hộp Petri, đợi
nguội 60
0
C, dùng panh lấy các phiến kính (lamelle) đặt nhẹ vào để sao cho có một lớp môi
trường bám vào tạo thành lớp mỏng trên một mặt của phiến kính. Lấp ba phiến kính đã phủ
môi trường như vậy đặt vào hộp Petri khác. Trong hộp Petri này có đựng một ít nước vô trùng
và một giá thuỷ tinh hình chữ U (các phiến kính đặt thẳng góc so với giá thuỷ tinh). Cấy nấm
men thành ba vết trên mỗi phiến kính. Phải cấy ba vết này cách nhau như thế nào để trên mỗi
vết có thể đặt vừa một lá kính mỏng (các vết cấy song song với chiều rộng của phiến kính).
Sau khi đặt lá kính một cách nhẹ nhàng và cẩn thận ta đậy hộp Petri lại và nuôi cấy ở 25-30
0
C
trong 4-5 ngày. Lấy ra và quan sát các vết cấy dưới kính hiển vi.
Một vài phòng thí nghiệm làm theo cách sau: nhỏ một ít môi trường thạch nóng lên
trên bề mặt phiến kính, láng đều để tạo thành một lớp thật mỏng. Sau khi khô bề mặt, cấy
một hoặc 2 đường dọc theo lam. Lấy lá kính mỏng đặt lên trên mỗi đường cấy. Đặt phiến kính
vào đĩa Petri và cho một ít nước vô trùng để tránh khô môi trường. Quan sát trên kính hiển vi
trong vài ngày.
Với các phương pháp trên rất dễ dàng quan sát thấy việc tạo thành khuẩn ty ở một số
loại nấm men.
5. Quan sát bào tử bắn (Ballistoconidium, Ballistospore):
Lấy 10-15ml môi trường nước chiết mạch nha, môi trường khoai tây - glucoza hay môi
trường bột ngô đưa vào một đĩa Petri khi thạch đông (nhớ làm khô vô trùng mặt thạch) lấy que
cấy để cấy nấm men theo hai đường vuông góc ở giữa sau đó úp ngược lên một đĩa Petri khác
chứa cùng môi trường nhưng không cấy nấm men. Trong đĩa Petri này chứa 1 lamelle vô trùng,
để ở 20
0
C sau 3 tuần bào tử bắn sẽ tạo thành các khuẩn lạc trên đĩa Petri chứa môi trường ở
phía dưới và lấy phần lamelle mang các bào tử bắn để đưa đi quan sát dưới kính hiển vi.
- Môi trường bột ngô:
Cân 60 gam bột ngô hoà vào trong 500ml nước sôi. Đun sôi tiếp 1 giờ. Lọc qua vải
màn. Thêm nước cho đủ 1000ml, thêm 20g thạch. Đun cho tan thạch rồi phân vào các dụng cụ
thuỷ tinh. Khử trùng ở nồi áp lực 120 phút trong 30 phút.
Cũng có thể phát hiện bào tử bắn theo các cách khác như sau:
Cấy các loại nấm men nghi ngờ có hình thành bào tử bắn lên môi trường thạch - mạch
nha (trên đĩa Petri hay ống nghiệm thạch nghiêng). Sau mấy ngày nuôi cấy trên mặt thủy tinh
đối diện với vết cấy sẽ có một hình ảnh mờ giống hệt với hình dáng vết cấy. Đó là các bào tử
bắn đã bắn ra lưu lại trên phía đối diện vết cấy.
Hoặc cấy nấm men theo đường thẳng hoặc zich zăc vào đĩa Petri chứa môi trường bột
ngô, để ở 20
0
C sau từng thời điểm 3, 5,7,10, 15 ngày. Úp ngược đĩa Petri lên một phiến kính
sạch, để qua đêm. Quan sát bào tử bắn trên phiến kính trên kính hiển vi.

6. Quan sát bào tử túi (ascospore):
Một số nấm men có khả năng hình thành bào tử hữu tính gọi là bào tử túi (ascospore
hay asconidium). Bào tử túi có khả năng bảo vệ nấm men chống lại với nhiều ảnh hưởng có hại
của điều kiện ngoại cảnh. Thường quan sát thấy bào tử túi của nấm men trong những môi
trường nuụi c?y lõu Có thể là do việc tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất đã kích thích quá
trình tạo thành bào tử túi. Trong tế bào của mỗi loại nấm men sinh bào tử túi thường tạo
thành một số lượng bào tử túi nhất định. Khi chứa bào tử túi thì tế bào được gọi là túi (asci, số
ít - ascus).
Thường mỗi túi có 4 bào tử, một số loài chỉ có 1-2 bào tử, một số rất ít loài lại có tới 8
bào tử. Bào tử túi ở nấm men có hình dạng rất khác nhau, đây cũng là một đặc điểm thường
dùng khi phân loại nấm men. Saccharomyces cerevisiae và rất nhiều loài nấm men khác có
bào tử túi hình cầu hay hình trứng. Hansenula anommala, Hanseniaspora có bào tử túi hình
bán cầu, phía dưới có mép như vành mũ, Pichia membranaefaciens có bào tử túi vô quy tắc (có
thể có hình trứng, dài, tam giác, bầu dục, bán cầu ), Hansenula saturnus có hình bào tử túi
hình quả xoài, ở giữa có một vành đai nhỏ. Bào tử túi Schawanniomyces occidentalis cũng có
hình dạng tương tự như vậy nhưng bề mặt có gai. Một số loại nấm men lại có bào tử túi dài, có
khi hình xoắn. Thường thường nấm men tạo thành bào tử túi sau 5-10 ngày nuôi cấy trên môi
trường thạch mạch nha. Muốn quan sát chỉ việc lấy một ít nấm men làm tiêu bản soi tươi
không cần nhuộm màu. Mục đích việc quan sát bào tử túi phải trả lời ba câu hỏi sau đây:
1. Nấm men có hình thành bào tử túi hay không.
2. Bào tử túi hình thành từ các tế bào dinh dưỡng không xảy ra sự tiếp hợp trước
đó hay là sau khi có sự tiếp hợp giữa hai tế bào dinh dưỡng; cũng có thể là xảy ra sau khi có
sự tiếp hợp giữa tế bào mẹ và tế bào con (tế bào nảy chồi) của nó.
3. Nghiên cứu hình dạng bào tử và số lượng của bào tử túi
Cách tiến hành:
Nấm men ‘trẻ’ sau khi nuôi cấy qua đêm được đưa vào môi trường malt - cao nấm men
- glucoza - pepton và để 2-3 ngày sau đó đưa chuyển vào môi trường sinh bào tử. Giữ ở 25
0
C
trong 3 ngày và quan sát dưới kính hiển vi. Nếu không quan sát thấy bào tử thì lại tiếp tục giữ
và quan sát từng tuần cho đến 6 tuần liền. Các môi trường hình thành bào tử có thể được sử
dụng là môi trường: V-8-agar, Gorodkowa-aga, acetat-agar, malt-yeast-glucoza, pepton-agar,
malt-acetat-agar. Tuy nhiên thường sử dụng các môi trường sau:
a. Môi trường miếng thạch cao:
Lấy hai phần bột thạch cao trộn với một phần nước làm thành bột nhão sau đó đổ vào
những cái khuôn làm bằng giấy da bò hay giấy thiếc (đường kính 1-1,5cm, cao 1,5-2cm).
Dùng dao làm cho nhẵn bề mặt. Sau khi thạch cao đông ta loại bỏ khuôn giấy rồi cho vào
những hộp thủy tinh đặc biệt gọi là hộp Koch. Cũng có thể làm những miếng thạch cao hình
tròn sau đó cho vào hộp Petri. Đổ nước ngập 2/3 chiều dày của miếng thạch cao sau đó đưa đi
khử trùng (120
0
C trong 30 phút). Cấy nấm men tươi (từ thạch nghiêng mới nuôi cấy 48 giờ
tuổi). Giữ 25
0
C trong vài ngày, lấy ra làm tiêu bản quan sát bào tử túi. Tsetlin (1913) đề nghị
trước khi cấy nấm men sang môi trường miếng thạch cao nên chuẩn bị nấm men tươi trên môi
trường có thành phần sau:
Nước cất: 100 ml
Glucoza: 5 g
KH
2
PO
4
: 0,2g
CaCl
2
: 0,05g
MgSO
4
: 0,05g
FeSO
4
: 0,001g
(NH4)
2
SO
4
: 0,5g
b. Môi trường miếng thạch cao cải tiến:
Cách tiến hành như trên nhưng bề mặt miếng thạch cao được làm ẩm bằng nước mạch
nha loãng hoặc dung dịch có chứa 2% manitol và 0,5% KH
2
PO
4
.
c. Môi trường Gorodkowa (1908)
Nước thịt: 1 g
Pepton: 1 g
NaCl: 0,5 g
Glucoza: 0,25 g
Thạch: 2 g
Nước: 100ml
d. Xử lý với tia tử ngoại:
Cấy nấm men lên môi trường Gorodkowa (môi trường c) rồi chiếu tia tử ngoại theo thời
gian khác nhau: 5, 10, 15 phút. Sau đó tiếp tục nuôi cấy và quan sát bào tử túi.
e. Môi trường thạch nước:
Môi trường này là môi trường nghèo chỉ có nước và thạch, không bổ sung thêm các chất
dinh dưỡng khác.
f. Môi trường Amano (1950)
Amano đề nghị dùng phương pháp sau: Cấy truyền hai lần nấm men trên môi trường
thạch thịt pepton, lấy nấm men đã nuôi cấy 24 giờ cấy sang môi trường sau đây:
Glucoza: 0,4 g
Axetat Na không ngậm nước: 1,4 g
Thạch: 20 g
Nước: 1000 ml
g. Môi trường dịch tinh bột khoai tây 0,5% (Almeida và Lacaza)
Cấy nấm men lên môi trường trên rồi nuôi cấy ở 37
0
C, sau đó quan sát bào tử túi theo
từng thời điểm thích hợp.
h. Môi trường Kleyn:
Natri glutamat (hay asparagin, pepton, glixin): 0,25g
Glucoza: 0,062g
NaCl: 0,062g
Natri axeta: 0,5g
KH
2
PO
4
: 0,012 g
K
2
HPO
4
: 0,02g
Biotin (có thể không cần): 2±
Dịch hỗn hợp I: 1 ml
Thạch: 2 g
Nước: 100 ml
Cách pha dịch hỗn hợp I: MgSO
4
- 0,4g; CuSO
4
- 0,002g; FeSO
4
- 0,2g; MnSO
4
- 0,2g; NaCl -
0,4g; nước cất - 100ml).
Chú ý: Quan sát bào tử túi là đặc điểm quan trọng trong phân loại, tuy nhiên trong một số
trường hợp khó có thể phát hiện thấy bào tử túi. Điều này có thể do các nguyên nhân sau:
- Môi trường sinh bào tử túi là không thích hợp.
- Chủng nghiên cứu là dị tản (heterothalic) hay đồng tản (homothalic).
- Bào tử túi khó phát hiện và do người làm phân loại còn thiếu kinh nghiệm.
- Nấm men nghiên cứu thuộc loại không sinh bào tử túi (anascoporogenous).

6. Quan sát đặc tính nuôi cấy
Để quan sát các đặc tính nuôi cấy của nấm men người ta thường cấy nấm men lên môi
trường dịch thể, môi thường thạch nghiêng và môi trường thạch đĩa (hoặc dùng chai Roux).
Cấy nấm men vào các ống nghiệm đựng 3ml môi trường mạch nha 10-15
0
Baling (xem phần
“Quan sát hình thái tế bào nấm men và đo kích thước”). Nuôi cấy ở 25
0
C rồi sau 24 giờ, 48 giờ,
72 giờ và 198 giờ lấy ra quan sát. Cần quan sát xem nấm men có phát triển ở bề mặt dịch thể
hay không. Nếu có thì chúng tạo thành váng phủ kín, váng phủ không kín hay tạo thành một
vòng quanh thành ống nghiệm. Nấm men có lắng xuống thì quan sát xem cặn có dạng xốp,
dạng nhày hay dạng rắn chắc. Quan sát xem chất dịch vẫn trong hay đã trở nên đục. Dùng tay
đập khẽ vào đáy ống xem cặn có nổi lên hay không (nếu cặn xốp thì dễ nổi lên, nếu cặn rắn
chắc thì khó nổi lên). Dùng que cấy khều cặn, nếu cặn nhày thì dễ khều lên cả tảng, nếu
không thì khó khều. Nếu có váng thì cần quan sát xem bề mặt váng như thế nào, khô hay ướt,
phẳng mịn hay nhăn nheo và cũng cần quan sát xem váng dày hay mỏng. Để quan sát sự phát
triển của nấm men trên môi trường thạch nghiêng ta cấy nấm men lên trường thạch - mạch
nha 12-15
0
Baling sau đó để ở tủ ấm 25-30
0
C. Quan sát ở ngày nuôi cấy thứ 3 và thứ 14. Chú
ý quan sát xem bề mặt của vết cấy là trơn nhẵn hay xù xì, ướt bóng hay khô, có nếp nhăn hay
không, màu sắc thế nào, mép thẳng hay mép răng cưa v.v Để quan sát khuẩn lạc ta đem
môi trường thạch - mạch nha hoặc môi trường gelatin - mạch nha phân vào các hộp Petri hay
bình Roux, bình Kolle. Dùng que cấy có đầu nhọn cấy nấm men thành một chấm ở chính giữa.
Trước khi cấy cần làm khô bề mặt (lớp thạch nên đổ dầy khoảng 5mm). Nuôi cấy ở 25
0
C trong
14 đến 30 ngày. Lấy ra quan sát khuẩn lạc lớn. Cần chú ý miêu tả:
- Kích thước khuẩn lạc (vẽ hình).
- Chiều dày khuẩn lạc (phải vẽ hình cắt ngang khuẩn lạc).
- Có tạo thành những vòng đồng tâm hay không?
- Có những hình tia phóng xạ hay không? (từ tâm đến giữa hay từ giữa đến mép?)
- Giữa khuẩn lạc lồi lên, lõm xuống hay phẳng?
- Bề mặt trơn, nhẵn, bóng, ướt hay xù xì, ráp, có cấu tạo nhung hay gai, có nếp nhăn
hay không?
- Màu sắc khuẩn lạc.

Xem chi tiết: Vi sinh vật học -6